治疗性IgG结构类似双特异性抗体结构模式多样性-长沙生物产业网 

治疗性IgG结构类似双特异性抗体结构模式多样性

2018-08-10 08:57

  自1986年FDA同意了第一个鼠源单抗—强生公司的OKT3(muromonab-CD3)使用于临床以来,依据抗体的免疫疗法取得了明显的开展。在接下来的这些年里,研讨人员运用基因工程办法将IgG基因克隆到许多表达载体中。上个世纪90年代,生物制药公司现已能够在人工培育的细胞中出产出全人源抗体。
  
  截止到2017年6月,FDA和EMA别离同意了63种和54种依据单抗的医治办法。全球单抗商场持续大幅扩张,现在已被用于多种疾病,如癌症、心血管疾病、缓慢炎症和病毒感染等的医治,也被使用于疾病检测和印象确诊。这类药物的成功,影响了对新的蛋白质工程办法的探究研讨,而这些办法又加快了双特异性抗体和多特异性抗体的开展。
  
  MAb是二价和单特异性的(1),但是双特异性抗体和多特异性抗体的规划却是为了结合2个或许更多的抗原表位。现在已有两种双特异性抗体被同意用于临床:?
  
  2009年,EMA同意Removab(catumaxomab)用于恶性腹水的医治,这是由费森美生物技能公司和三隆制药公司联合开发出产的一种IgG结构相似的双特异性抗体(2);2015年,EMA和FDA同意Blincyto用于难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的医治,这是由安进公司开发出产的一种非IgG结构的双特异性T细胞联接器(3,4)。
  
  还有更多的产品现在正处于临床研讨阶段,除了其它一些Removab适应症外,还有一个IgG相似结构的双抗体emicizumab已在日本完成了Ⅰ期和Ⅱ期临床试验,并被FDA认定为取得了突破性医治效果。别的还有4个IgG结构相似的双抗体在美国完成了Ⅰ期临床试验(5)。
  
  技能及其结构特色单抗是一种由重链和轻链折叠而成的具有独立结构和功用域的异四聚体糖蛋白(图1)。IgG分子的模块化域结构促进了蛋白质工程的开展,使为了创造出多种bsAbs所必需进行的分子结构的改构成为可能。
  
  在这篇总述中统称为bsAbs的双特异性和多特异性抗体,都至少保留了两个可变结合区这个根本结构,它们能够结合两个或许多个不同的抗原表位。
  
  像单抗相同,IgG结构相似的bsAbs能够履行许多不同的功用,包含呈上一种有效载荷(比方毒素或放射性标记的化合物),消除配体,作为受体拮抗剂,以及介导抗体依靠的细胞介导的细胞毒效果(ADCC)或补体介导的细胞毒效果(CMC)。但是,bsAbs的两层特异性为那些对单特异性抗体没有满足反响的疾病供给了额定的医治挑选。下面的“功用”栏列出了bsAbs的功用,而“优缺点”栏则列出了其与单抗体比较所存在的优势和不足之处。本总述的第2部分将对当时bsAbs的功用进行更具体的介绍。
  
  IgG结构相似bsAbs功用:结合配体,并按捺配体-受体间彼此效果;结合细胞外表受体,并按捺配体结合;结合一种毒力因子,并按捺细胞内吞效果或从内含体逃逸;结合细胞外表受体,并对其进行活化或消除;交联细胞外表受体,来削弱或阻挠细胞内的信号传导;结合细胞外表抗原,并经过Fc区与效应细胞和/或分子间的彼此效果诱导ADCC或CMC效应;结合免疫细胞活性外表受体(共受体),而且把它从头定位到表达一种特定的外表抗原的细胞类型;向靶细胞投递一种共价结合的有效载荷(如:细胞毒素,细胞活素,酶,或许药物填充胶束/纳米微粒)。
  
  优缺点:将IgG结构相似的bsAbs与单克隆抗体比照,明显有下面一些不同点:优势:多靶点通路;可防备穿插耐药的发作;具有交联细胞外表蛋白的才干;增强了穿插臂结合功率;增强了经过免疫细胞重定向的效应器功用;增强了放射疗法的靶向性,减小对非方针部位的损伤;增强了跨膜穿透才干。
  
  缺点:外源结构和序列的引进导致潜在的免疫原性增强;可能需求额定的蛋白质工程技能以及更屡次的挑选才干取得一个最优的方针分子;在进程开发中可能需求更多的时刻和资源,由于单抗体渠道可能并不适用于它们;结构方式是能够专利化的,需求授权答应才干运用。
  
  能够分为两大类:IgG结构相似的和非IgG结构相似的。IgG结构相似的保留了完好的IgG分子作为其主要的结构组分。非IgG结构相似的则由独立的IgG结构域或许几个结构域之间经过一段柔性的短肽链衔接所组成。在本文中,咱们要点重视IgG结构相似的,这些能够进一步区分为不同的亚类,例如:咱们能够依据其是否具有额定的结构润饰、附加元件、非化学交融或许化学结合物进行区分,也能够依据其是由IgG结构相似元件或许非IgG结构相似元件杂交发生而进行区分。图2为现在已开发的的扼要图示。
  
  IgG结构相似的bsAbs方式构建出一个具有正确的重链和轻链组合的产品是bsAbs产品开发中最大的应战。最开端,人们经过运用二次杂交瘤技能或许经过对2个母体IgG分子的次级组分进行重组来构建出未经润饰的IgG结构相似的bsAbs。但是这两种办法的功率都比较低下。在这两种情况下,重链(HCs)和轻链(LCs)都是经过随机组合来发生由很多种IgG分子组成的混合物。这种重链和轻链的随机组合一共能够发生10种不同的潜在组合,而只要1种才是咱们的方针产品,即既是二价的,又是双特异性的。在其他9种中,有2种为二价但单特异性的,4种为单价且单特异性的,别的3种则不能与任何抗原表位相结合。前期的研讨者们找到了一些办法来促进方针产品的构成,亦或方针产品的挑选性捕获。跟着蛋白质工程和分子建模范畴的开展,bsAbs结构方式变得越来多样化。
  
  根本型IgG结构相似bsAbs:大鼠/小鼠杂交发生的抗体TrioMAbs(图2A-2)是运用倾向配对法来使重链和轻链定向组合所发生的前期bsAb方式。大鼠/小鼠杂交瘤细胞所表达发生的HCs会倾向于与其相同物种的LCs配对。但是,由于不存在对HC异源二聚体的倾向性,它们会构成同源二聚体和异源二聚体。用protein A亲和层析对方针异源二聚体产品进行捕获,小鼠的HCs可与Protein A结合,大鼠的却不能。因此,大鼠的HC同源二聚体不能吸附到该填料上,而是直接流穿。HC异源二聚体和小鼠的HC同源二聚体与其结合,但前者的洗脱pH比后者较高,据此可将其别离纯化出来(6)。这种方式的bsAbs包含catumaxomab和ertumaxomab,虽然后者的Ⅱ期临床试验被取消了(7,8)。
  
  一起轻链型bsAb(图2A-3)是别的一种根本的IgG结构相似型bsAb,它是在2条不同的重链上各结合一条相同轻链来发生双特异性。Novimmune公司构建的λ/κ轻链型bsAbs(2A-4)是结合了两种不同类别的轻链(λ和κ),以促进终究产品的挑选性捕获。该捕获办法需求三个接连的亲和进程(Protein A亲和层析,κ亲和层析和λ亲和层析)(9)。
  
  图2:IgG结构相似bsAbs分子规划时运用整个IgG结构作为骨架,来构建一个具有双特异性或许多特异性的二价或多价抗体。IgG结构相似bsAbs能够分为三个重链润饰型IgG结构相似bsAbs根本类型:为了战胜这些复杂性,科学家们运用分子建模和蛋白质工程技能,来引进有利于HC异源二聚体构成的共同结构特征。
  
  由Ridgway等人于1996年在Genentech公司开发的knob-into-hole(KiH)HC技能(图2A-5)是最早施行的战略之一。这个knob是经过用一个较大的氨基酸替代坐落其间一条链与CH3交界处的氨基酸来完成,而hole则是用一个含有小侧链的氨基酸来替换另一条HC相对方位的氨基酸来完成。Knob和hole的存在使同源二聚体间由于存在较大的空间位阻而难以构成,然后促进了HC型异源二聚体的构成。在不同的细胞系中别离构建出knob型半边抗体和hole型半边抗体,然后将这两部分结合在一起,即可出产出高产量低错配率的方针产品(10,11)。
  
  KiH型润饰也被使用于CH1和CL区的改造,来引导HC-CL配对。例如:Zymeworks公司的双特异性抗体Azymetric(图2A-6)就是一起使用了CH3区KiH和CH1-CL区KiH润饰。
  
  兼容电荷对(图2A-7)与KiH润饰型bsAbs功用相似,它是运用同种电荷间的排挤力替代空间位阻来促进异源二聚体的构成。对应的CH3界面处的一个特定氨基酸被一个带相反电荷的侧链所替代,HC同型二聚体会因带有同种电荷而彼此排挤,而异源二聚体则比较安稳(12)。
  
  公司的SEEDbody技能(图2A-15)是用链交流技能改造结构域,将人的IgA和IgG分子CH3区改造为包含有交换片段的结构域。重链包含有易于构成互补的异源二聚体的结构域(13)。
  
  轻链润饰型IgG结构相似bsAbs根本类型:多特异性抗体CrossMab(图2A-8,2A-9,2A-10)的规划是为了削减重链和轻链间的错配。在这种方式中,Genentech公司的Schaefer等人运用基因工程技能把坐落其间一条Fab臂上的重链或轻链区经过方位交换改构成三种不同的结构(图3),这些区域间的穿插交换经过改动单个Fab臂上互补结构域界面的方位来明显下降HC-LC错配率(14-16)。
  
  公司的多特异性抗体LUZ-Y(图2A-17)经过可逆的重链和轻链润饰来促进正确配对。重链的C-结尾被加上互补的亮氨酸拉链来促进异二聚体的构成,用多肽链将重链的N-结尾与轻链的C-结尾相衔接然后引导HC-LC配对。亮氨酸和HC-LC间衔接肽可别离用Lys内肽酶(Lys-C)和弗林蛋白酶切除,然后得到一个仅有一个氨基酸不同于初始分子的终究产品(17-18)。
  
  DAF型,或“合二为一”型多特异性抗体(图2A-12),直接将双特异性整合进其每条Fab臂。每个Fab结构域一共包含有6个CDR区,Bostrom等经过与这些CDR区构成不同的组合,构建了一种能够结合2个不同抗原表位的Fab片段,因此每个Fab臂能够辨认2个不同的抗原表位。但是由于用作抗原辨认的CDR区存在堆叠,因此每个Fab臂每次只能结合一个抗原(19)。
  
  (图2A-12)与DAF IgG(图2A-13)相似,二者都是将其双特异性整合进两个Fab臂。在这种结构方式中,VH区结合一种抗原,而VL区结合别的一种抗原。因此,每个Fab片段能够结合两种不同抗原中的恣意一种。
  
  其它润饰:研讨者对根本的IgG结构作了一些其它的润饰,来促进方针HC-LC组合的构成,或许是增强其挑选性捕获。例如:关于HC链上Protein A结合区的润饰改造可用于HC异二聚体的挑选性捕获。除IgG3外,人类一切的IgG都与Protein A有亲和力,与同型二聚体比较,将与Protein A结合的两条重链CH3区中的恣意一条别离开来,都需求不同的pH值(20)。
  
  改动恣意一条Fab臂上CH1-CL中二硫键可增加HC-LC链的正确配对率,由于错配的结构不能构成二硫键,而且不如正确配对的结构安稳(21)。几种不同的润饰能够联合运用,使产品功率最大化。例如:Medimmune公司的DnetMab渠道(图2A-11)运用了一个包含有Protein A结合位点改造、HC型KiH和CH1-CL二硫键方位改动的组合(21);Creative Biolabs的Orthogonal Fab技能(图2A-14)是将HC型KiH与包含相容电荷配对在内的VH-CH1与VL-CL界面润饰相结合(22),而该公司的CrossMabs(图2A-8,2A-9和2A-10)渠道则是运用了KiH技能和结构域交换技能组合(14-16)。
  
  附加组分型IgG结构相似bsAbs包含有额定的与抗原相结合的抗体组分,通常用一段含有3个或以上SGGGG重复序列的短肽链衔接而成,这些与抗原相结合的抗体组分常常是从LC/HC的N-结尾或C-结尾延伸出来的IgG“片段”,这些片段包含独自的Fv片段(由VH和VL组成,图2B-1,2B-5,2B-7和2B-8)、独自的VH或VL结构域(图2B-6)、被称为单链可变区片段(ScFv,由VH和VL经过一段短肽链衔接而成,图2B-2,2B-3和2B-9)的改造过的Fv片段、抗原结合片段(Fab,由VH-CH1与VL-CL配对组合而成,图2B-4)或许(Fab’)2片段(由IgG抗体含铰链区在内的2个Fab臂所组成)。可结晶片段区(Fc)由铰链区和两条重链的CH2-CH3组成,它也可被规划成抗体骨架。虽然对Fc区域的润饰不能改动其价态及其对应抗体的特异性,但它却可能具有二次效应器功用,比方ADCC,Fc受体(FcγR)结合,以及与补体蛋白间的彼此效果(23,24)。它更多地是与非IgG结构相似的bsAb结合在一起。附加组分型的IgG能够是来自于一个单特异性抗体,上面别的添加了与抗原相结合的抗体组分,使它变成了一个双特异性抗体,或许是一个双特异性抗体上面别的添加了这些抗体组分,变成了多特异性抗体。
  
  这种附加组分型的IgG结构相似bsAb的一个比方是Abbvie公司的DVD-IgG技能(图2B-1),它是在每半边抗体上别离串联了2个不同的可变区;别的一个比方是“Morrison结构方式”IgG-ScFv(图2B-9),在这种方式中,IgG分子的每个重链C-结尾都连有一个ScFv链,然后发生一个四价的双功用抗体(25)。
  
  交融型或结合型或组分交融型的IgG结构相似bsAbs:结合型是用化学办法衔接到其它分子上,比方别的一个IgG分子上(图2C-1和2C-2)或许一个小分子上(图2C-3,2C-4和2C-6),其意图可能是获取额定的特异性,呈上一种载荷,或许增强血浆潴留等。这种类型包含Zybodies(Creative Biolabs公司,图2C-4),它是用模块辨认域(MRDs)与bsAb的重链和轻链N-结尾和/或C-结尾相衔接;以及CovX-bodies(Pfizer,图2C-3),它是运用一个骨架单抗作为基础,将非抗体结构的多肽结合异二聚体共价衔接到该骨架上(26)。
  
  不同于前一类型,组分交融型bsAbs为基因工程抗体。其每个独立成分被别离出产出来,然后经过非化学交联的办法组合起来。DNL方式(Dock-and-Lock,图2C-5)用了两种5’-cAMP活化蛋白激酶(即PKA)蛋白结合域,这些结合域使PKA安稳地二聚体化并衔接到AKAP(A激酶锚定蛋白)。经过将PKA或AKAP结构域与抗体,Fab,(Fab’)2或ScFv的C-结尾相衔接,在各自细胞系中发生DNL-交融体。DNL概念可用于结合多种不同的抗体组分,然后发生多种多价态的多特异性产品(27)。
  
  IgG结构相似的/非IgG结构相似的杂交型bsAbs:在IgG结构相似的/非IgG结构相似的杂交型bsAbs中,一个传统的IgG抗体组分与一个Fc交融的、非IgG结构相似的抗体组分配对。Teneobio公司现在正在开发的一种bsAb就是这种类型,它是将一个固定的轻链IgG抗体组分与一个VH直接与铰链-CH2-CH3交融构成的抗体组分相配对,然后将两个CH3结构域进行KiH型润饰来促进异源二聚体的构成(28)。
  
  展望在行将发行的本总述的后半部分(BPI 2018年1-2月刊),咱们将对IgG结构相似型bsAbs和单抗的特征进行比照,并在处理与其出产相关的上游产品和下流进程开发问题之前,评论其在疾病医治和确诊中的使用