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  简介      斑马鱼和线虫作为药物开发和毒性研讨的方式生物,在成像和剖析上的爱好日益增长。成体斑马鱼在长度上会成长至约4 cm,但是很多有用的研讨都是关于其受精后5天(5-dpf)的近乎通明的幼虫而开发,而幼虫的巨细约为< 4 mm。为此,96孔方式的微滴定板是最适合的实验板,因其孔有着满足的碳酸水容量,能保持斑马鱼的生计。此外,每孔中只放入1条鱼是对比抱负的,这么它的健康状况就不会影响到街坊的生计。      这些需要减慢了大多数显微镜和高内在成像体系的通量,由于即便在2倍放大率下,仍是需要对多个视场进行成像,以确保全孔都被掩盖。在此咱们展现了全新的IN Cell Analyzer 2000体系的特征怎么战胜这些艰难:(1) 大芯片照相机可以在2倍物镜下进行迅速的单图画全孔成像,而图画暗影最小;(2) 关于更高放大率的成像,用户操控的指令能移动/改动意图区域的物镜,而无缝的图画拼接能得到高分辨率的全孔图画;(3) 两种独立的主动对焦方式能完成准确的z-叠加,因而恣意两个器官的垂直间隔都可以断定。      办法      样品制备:      斑马鱼幼虫样品是由Phylonix Inc.奉送的。受精后5天的野生型斑马鱼先在三卡因中麻木,再用4%多聚甲醛固定。幼虫放置在#3599 Corning Costar 96孔板的150 μl固定培养基中。      图画获取:      图画是用IN Cell Analyzer 2000获取的。物镜为:2×/0.1 NA、4×/0.1 NA、10×/0.45 NA,使用透射光和荧光方式及恰当的滤光片和曝光时刻。大CCD照相机((Photometrics CoolSnap K4),加上2倍物镜,能取得7.6×7.6 mm2 的视场,在单次图画捕获中掩盖96孔板的全孔(直径6.4 mm)。      为了捕获z维的全部斑马鱼,咱们取得了Z-叠加物(图4),每次叠加100张图画,间隔10 μm(表2),总间隔为1000 μm。      图画拼接与剖析:      关于更高分辨率的全孔成像,在5%堆叠时使用了仪器的主动图画堆叠特征。这么就能对全孔或意图区域进行成像。以后,图画文件转移到IN Cell Investigator 1.5,在那里进行主动的图画拼接,发生1幅每个孔的图画。      幼虫在孔底部的放置、摆放及姿态      在研讨的样品中,麻木或固定的受精后5天斑马鱼幼虫沉在孔底部。体轴相关于板旁边面的摆放是随机的,但有一个附着倾向,即是斑马鱼头部对着孔壁。姿态多半是旁边面的,这么只能对1个双眼进行成像(图2)。约有10%的幼虫出现头部有些倾向腹部的姿态,在图画中就能看见1?到2个双眼